冷冻电子断层成像技术（cryoET）是一项正在快速发展且极具潜力的冷冻电镜技术。相对于冷冻电镜单颗粒技术，这项技术的最大优势是无需经过蛋白纯化流程，便可以研究生理状态或病理下的生物大分子的原位结构。聚焦离子束切割技术（cryoFIB）是目前用于制备生物样品最常用方法之一。然而，由于生物组织体积大，相应的冷冻电子断层成像样品制备仍然面临很多挑战，包括效率低、样品易碎和定位困难等，极大地限制了冷冻电子断层成像技术在生物组织样品上的应用。
2023年4月11日，清华大学生命科学学院李雪明课题组与首都医科大学北京友谊医院尤红课题组在《科学报告》（Scientific Reports）杂志上在线发表研究论文，题目为“使用聚焦离子束切割技术制备组织的冷冻电子断层成像样品”（CryoFIB milling large tissue samples for cryo-electron tomography）。该论文报道了一种基于聚焦离子束切割技术的组织样品制备工作流程，可以将毫米尺度的组织样品中的感兴趣区域高效减薄到100–150 纳米的厚度。该方法的开发为使用冷冻电子断层成像技术研究任意来源的生物样品提供了可能。
图1. 高效切割大型组织样品的整体工作流程
（a）组织预处理。（b）高压冷冻。（c）细胞二次电子像定位以及聚焦离子束切割。（d）聚焦离子束切割之后样品的扫描电镜图像。
研究团队针对组织切割过程中面临的技术难题，设计了一套完整的解决方案，包括组织样品的固定、预减薄、高压冷冻、聚焦离子束切割以及基于细胞二次电子像（CSEI）的定位（图1）。其中聚焦离子束切割策略包括一个粗切步骤和一个精修步骤。粗切步骤是使用高达65 nA电流和高入射角度的离子束进行切割，可以解决厚度达几十微米的样品切割效率问题（图2 a-c）。精修步骤则是用聚焦离子束切割制备出一个带有导电铂镀层的田埂状（Furrow-Ridge）结构，该结构是获得高质量冷冻电子断层成像数据的关键（图2 d-g）。一方面，Furrow-Ridge结构能很大程度上提高大面积切片的机械强度，使制备低至100 nm左右厚度的薄切片称为可能。薄切片对于实现近原子分辨率的子断层平均（sub-tomogram averaging）至关重要。另一方面，Ridge表面上的导电性铂镀层是良好接地的，能够显著消除高能电子束辐照样品时产生的表面电荷，以及由表面电荷引起的图像漂移问题，对提高电子断层图（tomogram）三维重构的分辨率具有重要意义。另外，研究团队通过将基于细胞二次电子像定位方法引入到组织样品切割过程中，不需要额外引入的荧光标记，就能对组织中的感兴趣区域进行定位。更重要地，细胞二次电子像技术可以在切割过程中进行持续实时成像，并能实现精确的三维定位。依托上述聚焦离子束切割策略，大组织样品的冷冻电子断层成像样品制备仅依托普通的冷冻双束扫描电镜就可以实现，无需额外的设备；用户仅需简单的培训就可以轻松上手操作。本文工作使用小鼠肝脏组织测试了整个样品制备的工作流程，成功定位并获得了纤维化肝脏中分布极少的胶原纤维高质量断层成像三维密度图，证明了工作流程的高效性和可行性。
图2 聚焦离子束粗切和精修过程
a-c 聚焦离子束粗切过程。d-g 聚焦离子束精修过程。
综上所述，该研究开发的工作流程解决了大型组织样品制备过程的主要瓶颈问题，将有效地促进冷冻电子断层成像技术在大尺寸组织样品中的应用。
清华大学生命科学学院李雪明副教授、首都医科大学北京友谊医院尤红教授为本文的共同通讯作者。清华大学生命科学学院2018级博士生王思涵、生命科学学院博士后周珩和首都医科大学北京友谊医院陈巍副研究员为该论文的共同第一作者。蔡司显微镜北京客户中心工程师蒋艺丰和首都医科大学北京友谊医院博士生严旭禛为本文的共同作者。清华大学李英博士、李晓敏博士为样品制备和数据收集提供了大力帮助和支持。本工作得到了国家自然科学基金、清华-北大生命科学联合中心、北京生物结构前沿研究中心和结构生物学高精尖创新中心的资助。